B1 玻片凝集試驗(yàn)
B1.1 目的
應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)Nm病原菌株或帶菌者菌株進(jìn)行血清學(xué)分群。
B1.2 材料
B1.2.1 待檢的Nm菌株純培養(yǎng)物。
B1.2.2 Nm診斷血清：多價(jià)I(包含A、B、C、D群)，多價(jià)Ⅱ〔包含1889(Y)、1890(H)、1892(29E)］，多價(jià)Ⅲ［包含319(W135)、1916(X)、1486(I)、1811(K)群］及各群?jiǎn)蝺r(jià)血清，共計(jì)14種。
B1.2.3 潔凈載玻片。
B1.2.4 生理鹽水。
B1.3 試驗(yàn)方法
B1.3.1 先將診斷血清按說明書稀釋成所需的濃度，滴一滴在潔凈的玻片上。
B1.3.2 用白金耳刮取菌苔少許，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均勻，再與血清混勻。
B1.3.3 輕輕搖動(dòng)玻片數(shù)次，在1～2min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者，即為陽性。
B1.3.4 檢查從病人分離的疑似Nm時(shí)，先試A群血清，若不與其發(fā)生凝集，則試用B或C群血清，仍不凝集時(shí)，則試用多價(jià)Ⅱ或多價(jià)Ⅲ血清。若發(fā)生凝集，再用單價(jià)血清定群。從病人分離的疑似Nm對(duì)現(xiàn)有診斷血清皆不凝集者則送研究單位進(jìn)一步鑒定。
B1.3.5 在玻片上與各群診斷血清、鹽水或正常兔血清皆發(fā)生凝集者，即定為自凝菌。
B2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
B2.1 目的應(yīng)用ELISA間接法測(cè)病人急性期和恢復(fù)期血清中的抗體水平。此方法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測(cè)定。
B2.2 材料
B2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀。
B2.2.2 聚苯乙烯板(40孔或96孔)。
B2.2.3 加樣器(單頭或4頭或8頭，定量為0～200μL)。
B2.2.4 羊抗人IgG辣根過氧化酶結(jié)合物。
B2.2.5 試驗(yàn)質(zhì)控血清(抗體陽性和陰性的人血清)。
B2.2.6 菌體抗原(A、B和C群Nm標(biāo)準(zhǔn)菌株)或A群Nm多糖菌苗。
B2.2.7 包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液)：
碳酸氫鈉(NaHCO3) 2.9g
碳酸鈉(Na2CO3) 1.6g
疊氮鈉(NaN3) 0.2g
加蒸餾水至1000mL，pH9.6，置4℃可備用兩周。
B2.2.8 洗滌液(0.5mol/L氯化鈉)：
氯化鈉(NaCl) 29.3g
吐溫－20(Tween－20) 0.5mL
加蒸餾水至1000mL，臨用前配制。
B2.2.9 稀釋液：
氯化鈉(NaCl) 8.0g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.2g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 2.9g
氯化鉀(KCl) 0.2g
吐溫－20(Tween－20) 0.5mL
加蒸餾水至1000mL，pH7.4，置4℃?zhèn)溆谩?br />
B2.2.10 底物緩沖液：
(1)0.2mo1/L磷酸氫二鈉
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 35.8g
蒸餾水 500mL
(2)0.1mol/L檸檬酸
檸檬酸〔C3H4(OH)(COOH)3·H2O］ 10.5g
蒸餾水 500mL
(1)液和(2)液分別置4℃?zhèn)溆谩?br />
臨用前按下述配方配制底物溶液，pH為5.0：
(1)液 2.57mL
(2)液 2.43mL
鄰苯二胺 4mg
蒸餾水 5mL
30％H2O2 15μL
B2.2.11 填充液：
稀釋液 100mL
白明膠或牛血清白蛋白(Bovine Serium Albumin，BSA) 0.5g
B2.2.12 終止溶液：2mo1/L硫酸(H2SO4)。
B2.3 試驗(yàn)步驟
B2.3.1 包被抗原的制備
將Nm純培養(yǎng)的菌苔刮到生理鹽水中，離心(3000r/min，30min)洗滌菌體3次，再混懸于生理鹽水中，置56℃30min滅活，用比濁法測(cè)定菌懸液中細(xì)菌濃度，用包被液將其稀釋成106個(gè)菌/mL作為包被抗原。對(duì)于A群Nm，亦