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乙類：流行性腦脊髓膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 GB 16884-1997

作者：佚名　|　來(lái)源：不詳　|　發(fā)布日期：07-11-01 15:39:17　| 點(diǎn)擊次數(shù)：[]　|　文字調(diào)整[大][中][小]

Triphenyl　Tetrazolium　Chloride，TTC)瓊脂培養(yǎng)基(TTC瓊脂)
　　B3.2.5.1　TTC瓊脂配方：
　　牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，日本多胨3.0％，可溶性淀粉0.2％，以蒸餾水配制，調(diào)pH7.4～7.6，瓊脂0.5％。
　　B3.2.5.2　TTC瓊脂制作
　　上述培養(yǎng)基成分熔化后，按每10mL或20mL分裝于大試管，121℃滅菌15min，冷卻后置4℃?zhèn)溆谩ＥR用前將培養(yǎng)基加熱熔化，每10mL培養(yǎng)基加50％葡萄糖注射液0.1mL，1％TTC水溶液(4℃避光保存)0.1mL，混勻放在45℃水溶液中待用。
　　B3.2.5.3　陽(yáng)性參考血清
　　用Nm免疫兔制備的診斷血清，未加防腐劑，經(jīng)預(yù)試測(cè)定其殺菌抗體滴度較高(1∶3200以上)。
　　B3.2.5.4　滴管與滴頭
　　采用臨床上輸液用的玻璃輸液接頭作滴管，滴頭采用12號(hào)輸液針，在砂輪上磨去針頭的斜面部分，使其下口呈圓形。用滴管與滴頭滴稀釋液應(yīng)是40滴/mL±2滴/mL。它們可用于滴加稀釋液、補(bǔ)體、靶菌液、TTC瓊脂及待檢血清。如有條件，血清最好用25μL移液器稀釋。
　　B3.3　殺菌抗體測(cè)定步驟
　　B3.3.1　靶菌液的制備
　　B3.3.1.1　開啟A、B或C群Nm菌種，接種到巧克力色瓊脂平皿上，37℃二氧化碳孵箱或燭缸培養(yǎng)15～20h，挑取3～5個(gè)菌落涂于另一平皿，同上培養(yǎng)10～15h。
　　B3.3.1.2　用Nm診斷血清和生理鹽水進(jìn)行玻片凝集及顯微鏡檢查，以核實(shí)菌種。
　　B3.3.1.3　菌種被確證以后，取其菌苔，混勻于2mL滅菌脫脂牛奶管中，制成濃菌液，分裝若干支小試管，每管約0.2mL，置-20℃以下保存，Nm可存活3～6個(gè)月。
　　B3.3.1.4　需用靶菌時(shí)，取出一支上述牛奶菌種管，熔化后立即轉(zhuǎn)種并放在4℃冰箱內(nèi)保存，供每日分離靶菌制作菌懸液，可備用2周。在測(cè)定抗體的過(guò)程中，每次所用靶菌傳種的代數(shù)保持一致。
　　B3.3.1.5　從所分離的靶菌平皿上挑取3～5個(gè)典型菌落，涂抹轉(zhuǎn)種1/4巧克力色瓊脂平皿，37℃燭缸培養(yǎng)4～6h，刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀釋液的試管壁上用白金耳將其充分研磨，制成輕度混濁的均勻菌懸液，其光密度值相當(dāng)于0.1。
　　B3.3.1.6　取出上述菌懸液2mL加到0.5cm的比色杯內(nèi)，在波長(zhǎng)為540nm的分光光度計(jì)上測(cè)其光密度值。
　　B3.3.1.7　稀釋液用量按式(B1)計(jì)算：
　　X＝OD×10-0.1……………………………(B1)
　　式中：X--稀釋液用量，mL；
　　OD--光密度值。
　　按照式(B1)計(jì)算稀釋液用量，然后往里加入0.1mL靶菌懸液，此時(shí)相當(dāng)于光密度值為0.1的靶菌液作了10倍稀釋。吹吸均勻后，由其開始再連續(xù)作10倍稀釋至10－5稀釋度，以菌液的最終濃度為每毫升含4000個(gè)菌落形成單位為宜。稀釋時(shí)每個(gè)稀釋度更換一個(gè)移液槍頭。
　　B3.3.1.8　稀釋好的靶菌懸液在1h內(nèi)用完。若室溫較高，可將菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。
　　B3.3.2　殺菌抗體的測(cè)定
　　B3.3.2.1　先在微滴板每孔內(nèi)加1滴相當(dāng)于25μL的稀釋液。
　　B3.3.2.2　用移液器從每排第一孔內(nèi)加25μL經(jīng)56℃30min滅活的待檢血清，吹吸5～10次后吸出25μL至下一孔，如此作連續(xù)倍比稀釋至最后一孔。每份血清分別用一支移液槍頭。
　　B3.3.2.3　從低溫冰箱內(nèi)取出補(bǔ)體，于37℃溫水中搖動(dòng)將其速溶，每孔加一滴。若補(bǔ)體已冷凍干燥，可往安瓿內(nèi)加相當(dāng)于補(bǔ)體血清原體積的稀釋液，使其融化后即刻使用。
　　B3.3.2.4　每孔加一滴稀釋成合適濃度的靶菌菌液，微滴板置微型振蕩器上中速振蕩5min，再在37℃培養(yǎng)25min，取出后重復(fù)上述振蕩。
　　B3.3.2.5　每孔加2滴已熔化冷至45℃左右的TTC瓊脂后，微滴板置37℃燭缸內(nèi)培養(yǎng)15～20h后觀察結(jié)果。
　　B3.3.2.6　每次試驗(yàn)需做下列對(duì)照：
　　陽(yáng)性參考血清對(duì)照；4孔補(bǔ)體對(duì)照(稀釋液、補(bǔ)體、菌液各一滴，檢查補(bǔ)體自然殺菌活性)；4孔細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照(稀釋液、滅活補(bǔ)體和靶菌菌液

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