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乙類：流行性腦脊髓膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 GB 16884-1997

作者：佚名　|　來源：不詳　|　發(fā)布日期：07-11-01 15:39:17　| 點(diǎn)擊次數(shù)：[]　|　文字調(diào)整[大][中][小]

可將A群Nm多糖菌苗稀釋到10μg/mL進(jìn)行包被。
　　B2.3.2　抗原的包被
　　用蒸餾水把酶標(biāo)板各孔沖洗干凈，空干水，置37℃烘干；往每孔中加包被抗原100μL，置4C過夜；傾出孔內(nèi)液體，用洗滌液沖洗各孔3次，每次1min，并且均在干凈的吸水紙上或紗布上拍打酶標(biāo)板，空干孔內(nèi)的液體。
　　B2.3.3　填充
　　空干孔中液體，用1mL吸管加填充液，每孔加以0.25mL；置室溫30min，同上洗滌，空干孔內(nèi)液體；酶標(biāo)板置塑料袋中，密封貯存于4C，可備用一個(gè)月。
　　B2.3.4　檢測(cè)待檢血清
　　B2.3.4.1　病人急性期和恢復(fù)期血清均從此1∶2開始，用稀釋液連續(xù)倍比稀釋到第7孔，第8孔以稀釋液代替血清作為陰性對(duì)照之一；酶標(biāo)板置37℃培育1h后同上洗滌。
　　B2.3.4.2　加酶結(jié)合物
　　上述酶結(jié)合物用稀釋液稀釋到預(yù)試測(cè)定的最適工作濃度，每孔加100μL，置37C反應(yīng)1h后同上洗滌酶標(biāo)板。
　　B2.3.4.3　每孔加B2.2.10中配制的底物溶液100μL，置37℃反應(yīng)15min。
　　B2.3.4.4　終止反應(yīng)
　　每孔加2mol/L硫酸(H2SO4)50μL。
　　B2.3.4.5　測(cè)光密度值
　　在495nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的光密度值，并記錄。
　　B2.3.4.6　每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置下列對(duì)照：
　　陽性和陰性血清質(zhì)控對(duì)照；抗原對(duì)照(以稀釋液代替待檢血清，其余同試驗(yàn)組)；緩沖液對(duì)照(以包被液和稀釋液代替抗原和待檢血清，其余同試驗(yàn)組)。
　　B2.3.4.7　結(jié)果判定
　　若被檢孔的光密度值與平行對(duì)照孔的光密度值比值(P/N)≥2，即判斷為陽性反應(yīng)。
　　B3　殺菌力試驗(yàn)
　　B3.1　目的
　　應(yīng)用微量殺菌力試驗(yàn)(TTC法)測(cè)定病人急性期和恢復(fù)期血清中對(duì)Nm的殺菌抗體水平。此方法也可用于健康人群的血清抗體測(cè)定。
　　B3.2　材料
　　B3.2.1　靶菌：對(duì)補(bǔ)體的自然殺菌作用具有耐受性，但對(duì)殺菌抗體反應(yīng)敏感的Nm(A群29019，B群和C群Nm)。
　　B3.2.2　稀釋液：Dulbeccos磷酸鹽緩沖鹽水
　　A液：氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1.15g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，蒸餾水800mL；
　　B液：氯化鈣(CaCl2)0.1g，蒸餾水100mL；
　　C液：氯化鎂(MgCl2·6H2O)0.1g，蒸餾水100mL。
　　上述三液分別滅菌121℃，15min，置4℃?zhèn)溆谩Ｐ栌脮r(shí)按A液8份，B液和C液各1份的比例混合，pH為7.1。
　　使用時(shí)每100mL稀釋液加滅活小兔血清1mL，萬古霉素500μg，多粘菌素B2500單位或硫酸抗敵霉素5000單位。配就的稀釋液盛于小瓶中，置4℃?zhèn)溆?周。
　　B3.2.3　滴定板：底部呈"U"形的96孔有機(jī)玻璃微滴板，并備用同樣大小的普通玻璃作蓋板。將它們平放在80℃的烤箱內(nèi)烤2h后備用。試驗(yàn)完畢，以約80℃的熱水泡板1h殺死靶菌，再以自來水沖洗干凈，并用棉棒拭凈不潔凈的孔。最后以蒸餾水沖洗一次，37℃烤干后同上于80℃干烤。
　　滴定板使用一段時(shí)間后或遇到雜菌污染較嚴(yán)重時(shí)，可用熱水殺死靶菌并沖洗干凈；在比較稀的硫酸重鉻酸鉀清潔液內(nèi)浸泡4h，沖洗干凈后同上處理備用。
　　B3.2.4　兔補(bǔ)體
　　B3.2.4.1　補(bǔ)體可從幼齡兔或成齡兔血清中篩選，預(yù)試測(cè)定要求它們既不能具有自然殺靶菌的活性，但加有已知陽性參考血清時(shí)應(yīng)產(chǎn)生較高殺菌抗體滴度。不過，幼齡兔被選中的機(jī)率較高。
　　B3.2.4.2　將所選家兔從頸動(dòng)脈放血或抽取全部心血，置4℃，待血液凝固后盡早分離血清，混合后，分裝到2mL安瓿中，每只放1mL血清。立即將安瓿置-20℃以下冰箱內(nèi)冷凍過夜，次日進(jìn)行冷凍干燥。凍干以后再抽樣檢查時(shí)，不應(yīng)出現(xiàn)非特異殺菌反應(yīng)，特異殺菌抗體滴度在1：3200以上則保存在-20℃以下冰箱內(nèi)，可備用3～6個(gè)月。為減少補(bǔ)體批次間的差異，可將所選定的兔血清混合后進(jìn)行冷凍干燥，再作質(zhì)量檢定，合格者則保存于-20℃以下。
　　B3.2.5　氯化三苯四氮唑(

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